ACCT è uno strumento di conteggio automatico delle cellule veloce e accessibile che utilizza l'apprendimento automatico per la segmentazione delle immagini 2D

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 8213 (2023) Citare questo articolo

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Il conteggio delle cellule è una pietra miliare nel monitoraggio della progressione della malattia nelle neuroscienze. Un approccio comune per questo processo prevede che ricercatori qualificati selezionino e contino individualmente le cellule all'interno di un'immagine, il che non solo è difficile da standardizzare ma richiede anche molto tempo. Sebbene esistano strumenti per contare automaticamente le celle nelle immagini, la precisione e l'accessibilità di tali strumenti possono essere migliorate. Pertanto, introduciamo un nuovo strumento ACCT: conteggio automatico delle celle con segmentazione Weka addestrabile che consente un conteggio automatico flessibile delle celle tramite la segmentazione degli oggetti dopo l'addestramento guidato dall'utente. L'ACCT è dimostrato con un'analisi comparativa di immagini di neuroni disponibili al pubblico e un set di dati interno di cellule microgliali colorate con immunofluorescenza. A titolo di confronto, entrambi i set di dati sono stati contati manualmente per dimostrare l'applicabilità dell'ACCT come mezzo accessibile per quantificare automaticamente le cellule in modo preciso senza la necessità di cluster di calcolo o di preparazione avanzata dei dati.

La quantificazione delle cellule nelle immagini immunofluorescenti è stata a lungo un passo limitante sia in termini di tempo che di impegno per l'analisi dei dati microscopici utilizzati nella ricerca. Queste tecniche di analisi selettiva delle immagini possono fornire preziose informazioni fisiologiche e i conteggi manuali eseguiti da professionisti qualificati sono stati considerati il ​​"gold standard" per la quantificazione1,2.

Qui abbiamo utilizzato i conteggi manuali completi di più osservatori separati per il confronto con una metodologia di conteggio automatico delle cellule. Tradizionalmente, un aspetto importante per mantenere la coerenza nella quantificazione cellulare è garantire che un set di dati venga conteggiato da un singolo osservatore che mira all'accuratezza e alla riproducibilità pur essendo idealmente cieco rispetto alle condizioni sperimentali. Ciò limita enormemente la velocità con cui i dati sul conteggio delle cellule possono essere elaborati, poiché l’aumento della manodopera non sempre si traduce in una maggiore velocità. Il conteggio manuale può avere difficoltà in termini di riproducibilità e coerenza in un set di dati a causa dell'errore umano e della fatica. Tali problemi possono essere evitati utilizzando modelli computazionali che rimangono coerenti su un numero qualsiasi di immagini.

A tale scopo presentiamo qui ACCT: conteggio automatico delle cellule con segmentazione Weka addestrabile (TWS) ospitato su GitHub all'indirizzo https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git. TWS fornisce una base di apprendimento automatico per la nostra metodologia accessibile di conteggio automatico delle cellule, con ulteriore potenziale di elaborazione delle immagini fornito da script in ImageJ, Python e BeanShell3,4. Il programma TWS fornisce un'interfaccia utente grafica (GUI) per l'addestramento e l'applicazione di un classificatore di apprendimento automatico che distingue tra pixel cellulari e non cellulari, che vengono poi raggruppati in oggetti cella e contati. L'ACCT è costruito attorno a questa segmentazione dei pixel per fornire una convalida quantitativa a livello cellulare e assistere nella selezione e nell'applicazione ottimali del classificatore (Fig. 1). ACCT elabora le immagini a canale singolo fornite dagli utenti. Le immagini con più canali possono essere analizzate utilizzando copie di immagini che mostrano un canale alla volta ed elaborano i set di immagini per ciascun canale separatamente.

In questo studio vengono utilizzati due set di dati per dimostrare le prestazioni in vari contesti di imaging. Il primo set di dati utilizzato comprende immagini di microglia in topi con e senza condizioni di attivazione del sistema immunitario e dell'infiammazione causate dall'espressione transgenica della proteina dell'involucro gp120 del virus dell'immunodeficienza umana-1 (HIV-1)5. Questo modello di NeuroHIV (topo HIVgp120tg) fornisce un risultato osservabile dai conteggi manuali, un aumento della microglia in presenza di HIVgp120 (di seguito denominato Attivato) rispetto all'assenza della proteina virale (controllo non transgenico della figliata, denominato Riposo). L'ACCT è stato utilizzato per valutare la differenza nei numeri di cellule microgliali dalle immagini rappresentate in Fig. 2. Affinché una metodologia di conteggio automatico sia efficace in un contesto sperimentale, deve essere in grado di accogliere la variabilità nella presentazione dei dati risultante dalle condizioni sperimentali6. È noto che le microglia subiscono cambiamenti morfologici durante l'attivazione che ne alterano la morfologia e l'aspetto quando vengono visualizzate mediante colorazione immunofluorescente7,8. Ci concentriamo su un set di dati di immagini di cellule marcate con immunofluorescenza per la proteina-1 adattatrice legante il calcio ionizzato (Iba-1) che è un marcatore specifico del tipo di cellula e consente di visualizzare la microglia. Tuttavia, la metodologia e gli script di accompagnamento consentono la quantificazione automatica delle cellule in un'ampia gamma di contesti di imaging.